所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。·Real-timePCR是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關系，所以成為定量的依據(jù)。Quantagene q225 系列熒光定量PCR 系統(tǒng)主要特點：精確定量、快速高效、小巧輕便。湛江熒光定量qPCR儀應用

傳統(tǒng)定量PCR方法簡介：1）內參照法：在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內標也被擴增。在PCR產(chǎn)物中，由于內標與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內標為對照定量待檢測模板。2）競爭法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。擴增后用內切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結合，再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內標，作出標準曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。上海高效qPCR儀消毒SYBR Green是一種DNA插入染料用于qPCR。雖然SYBR Green方法比探針方法便宜，但是特異性沒有熒光探針方法好。

合成引物時需注意：在設計PCR引物時，首先確定要擴增的DNA區(qū)域，并設計一對專門位于目標區(qū)域的引物，一個在正向鏈上，另一個在反向鏈上。引物須具有特異性，避免擴增出非特異性片段。正向引物與反向引物應具有相似的退火溫度，GC含量與退火溫度相關，調整引物長度可以改變退火溫度。避免引物序列有二級結構或引物二聚體，會降低PCR效率。許多的在線工具可用于輔助引物設計。PCR擴增包括三組被設定好的時間和溫度，步驟為：變性，退火和延伸1、變性：PCR的第一步稱為變性，將模板DNA加熱到95°C幾秒鐘，將兩條DNA鏈分開，使它們之間的氫鍵迅速斷裂。2、退火：反應混合物冷卻30秒至1分鐘。退火溫度通常為50-65°C，但確切的比較好溫度取決于引物的長度和順序。不同的引物可能具有不同的退火溫度。3、延伸：溫度升至混合物中存在的DNA聚合酶的理想工作溫度，通常約為72°C。DNA聚合酶附著在每個引物的一端，并合成與模板DNA互補的DNA新鏈。

實時熒光定量PCR所使用的熒光物質可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下：1. TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。2. SYBR熒光染料：在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR與雙鏈DNA進行結合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應是否特異。3.分子信標：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結構的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光。qPCR只能實現(xiàn)相對定量，即必須使用標準品生成標準曲線，才能進行定量。

TaqMan qPCR：該測定不使用嵌入染料，而是使用帶有 5' 熒光報告染料和 3' 淬滅染料的 TaqMan 探針。 這些探針是目標特異性的，并且在退火步驟中與引物之一下游的目標 DNA 序列結合。 當 Taq 聚合酶在延伸階段遇到 TaqMan 探針時，它會置換并切割 5' 報告染料。 一旦報告染料與淬滅染料分離，其在每個 qPCR 循環(huán)結束時的可測量熒光信號就會顯著增加。 第二條 DNA 鏈是平行合成的，但由于沒有探針附著在它上面，因此無法通過熒光測量來監(jiān)測這一過程。與 SYBR Green 檢測相比，使用 TaqMan 探針的成本更高，但也具有兩個顯著優(yōu)勢：TaqMan 檢測測量目標序列的擴增進程，因為探針是目標特異性的。您可以通過向主混合物中添加不同的引物和具有不同報告染料的 TaqMan 探針來監(jiān)測單個反應中各種 qPCR 產(chǎn)物的數(shù)量。 這種多重方法允許您在每個熱循環(huán)結束時檢測多個熒光信號。qPCR面對小的差異較弱，dPCR則可識別差異較小的拷貝數(shù)。珠海Quantagene q225qPCR儀消毒

利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量準確，重現(xiàn)性比較好的定量方法，已得到全世界的公認。湛江熒光定量qPCR儀應用

qpcr的檢測原理：qPCR主要是使用插入染料或熒光探針(例如TaqMan)，利用實時積累的熒光信號監(jiān)測整個擴增過程，然后通過標準曲線來對未知模板進行定量分析。qPCR 主要是依賴于標準品制備標準曲線，進而去確定未知樣品的濃度，因此是一種相對定量的方法。隨著PCR的循環(huán)進行，染料熒光強度增加，從而檢測到定量反應的DNA。SYBR Green是一種DNA插入染料，范圍廣用于qPCR。雖然SYBR Green方法比探針方法便宜，但是特異性沒有熒光探針方法好。湛江熒光定量qPCR儀應用

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